研究·背景
肺癌是迄今为止癌症死亡的主要原因，几乎占所有癌症死亡的25%。每年，死于肺癌的人数超过死于结肠癌、乳腺癌和前列腺癌的总和。开发新的安全疗法非常重要。实体瘤（例如肺癌）的主要特征之一是它们的酸性微环境。
尽管这已为人所知近年（又名有氧糖酵解或Warburg效应），但它作为治疗靶点主要被忽视了。最近对肿瘤微环境酸度的了解表明其对疾病侵袭性、耐药性和耐辐射性以及患者整体预后不良的影响。
无定形碳酸钙(ACC)是一种非结晶形式的碳酸钙，由纳米尺寸的颗粒组成，具有已知的缓冲能力。这项工作描述了显示ACC抗癌作用与其缓冲活性相关的体内和体外结果。ACC作为一种抗癌安全疗法具有巨大的治疗潜力。
本论文描述了无定形碳酸钙(ACC)的使用，这是一种普遍存在且高度可溶的碳酸钙形式，由纳米级颗粒组成作为两种肺癌动物模型的潜在治疗方法：Lewis肺癌(LLC)和具有A（NSCLC人类细胞系）的异种移植模型。
在这两种模型中，肿瘤体积在治疗期间进行了评估，在LLC模型中还测量了组织蛋白酶B的活性水平。此外，我们想评估ACC对体外培养的A基因表达的影响。
研究·内容
肺癌肿瘤微环境(TME)是一个复杂的微环境，具有异常血管生成、酸中毒和缺氧区域。由于细胞代谢途径从氧化磷酸化(oxphos)转变为糖酵解，肿瘤的微环境、炎症和缺血通常伴随着细胞外pH值的降低（酸中毒）。
这种酸中毒现象源于癌细胞经历的代谢和遗传变化（基因表达的突变或变化），即使在氧气存在的情况下，也会导致癌细胞代谢向糖酵解转变，称为Warburg效应或有氧糖酵解，从而导致可以产生质子（氢阳离子）和乳酸。
质子和乳酸通过一系列酸转运蛋白（如MCT、NHE和质子泵）外流，导致肿瘤微环境酸中毒(TME)，降低细胞外pH(pHe)并防止癌细胞中的细胞内酸度(pHi)。细胞外瘤周环境的酸化以多方面的方式对肿瘤有利。它对肿瘤细胞和非肿瘤细胞的作用不同，以促进肿瘤的恶性发展。
以下是一些示例：
(1)酸性环境作用于非癌细胞信号和转录途径，导致蛋白水解酶的释放，例如组织蛋白酶和基质金属蛋白酶(MMPs)，导致肿瘤组织结构较差。此外，由于坏死或半胱天冬酶介导的p53依赖性细胞凋亡途径的激活和正常细胞的死亡，它会诱导正常细胞死亡。这些现象促进侵袭和转移，增加肿瘤的侵袭性。
(2)TME酸度的另一个方面是它对免疫系统的影响。免疫（癌细胞的另一个标志）是一个动态过程，肿瘤通过该过程改变其免疫原性以逃避免疫反应。TME酸度为抗肿瘤免疫反应产生了不利的环境。它降低CD8+T细胞、树突状细胞(DC)、单核细胞、自然杀伤(NK)细胞的功能和/或增加髓源性抑制细胞(MDSC)浸润或M2极化巨噬细胞，对NK和T细胞。
(3)TME酸度还与肿瘤化学抗性和放射抗性相关。甚至有人认为TME酸度会影响抗体的生物活性和分布，从而可能干扰包括免疫检查点抑制剂在内的治疗性抗体的临床疗效。
调节肿瘤酸中毒已被建议作为新疗法的潜在目标，实验模型表明，通过使用碳酸氢盐或非挥发性缓冲液和一种名为L-DOS47的化合物，可以抑制转移并提高肿瘤的pH值，该化合物处于早期临床试验阶段，旨在提高TMEpH值调制。
碳酸氢钠的临床试验未能将剂量增加到第二剂量水平以上，这主要是由于味觉不佳和1-2级胃肠道紊乱，导致依从性差。
为了评估不同的治疗是否影响肿瘤生长速率，我们比较了每个测量日每个治疗组的肿瘤体积差异。
对于LLC体内和组织蛋白酶B，结果通过ANOVA进行比较，然后进行Tukey的多重比较测试。显着性设定为P0.05。
对于A异种移植物研究，不同治疗组的肿瘤体积差异通过未配对的双尾学生t检验进行分析，用于确定两组之间的差异。显着性设定为P0.05。
通过将每种处理与另一种处理进行比较来分析差异基因表达，如下所示：ACC与对照相比（A与B。padj低于0.05且倍数变化高于1.1且每个细胞计数超过30的结果被视为具有统计学意义。
研究·结果
*01
在这项研究中，在两种肺癌体内模型中评估了ACC对肿瘤生长速率的影响；LLC皮下模型和A皮下异种移植模型。结果显示，在两种模型中，与对照（载体处理的动物）相比，ACC对减缓肿瘤生长速率产生了显着影响（图：1、2和4A和4B）。
在LLC模型中，ACC的效果与用化疗药物顺铂治疗的阳性对照动物的效果相似（图1和图2）。
当顺铂和ACC联合使用时，发现了最深远的影响。与其他治疗相比，这种联合治疗的肿瘤生长率最低，具有统计学显着性（图1和图2），可能表明存在协同效应。
图1
Figure1.TumorgrowthratesbetweenthedifferentgroupsthatwereadministeredIPwiththefollowingtreatments:Saline(negativecontrol),Cisplatin(positivecontrol),ACC,ACCandCisplatin,n=8,pergroup.DataispresentedasMean±SEM.
图1和图2中的结果表明，ACC治疗以与顺铂治疗类似的方式降低了肿瘤生长速率，在第26天，这两种治疗都明显优于载体治疗的动物。
*02
从第18天开始影响肿瘤体积（类似于ACC和顺铂的组合），并且顺铂的作用仅在研究的最后一天才显着（图2）。
图2
Figure2:Thisfigureshowstumormean±SEMofeachtreatmentduringtheexperiment.N=8,pergroup,dataispresentedasMean±SEM,statisticaldifferencesarerepresentedwithdifferentletters.Eachdatasetwasanalyzedforthesametreatmentday(p0.05).
此外，ACC和顺铂治疗的组合导致抗肿瘤作用增强，与所有其他治疗相比具有统计学显着性。
*03
来自用ACC和顺铂治疗的小鼠的肿瘤在实验的第26天被切除，与载体相比，组织蛋白酶B活性以统计学上显着的方式降低。
组织蛋白酶B活性在酸性环境下会增加，并且与肿瘤的侵袭性有关。
当检查组织蛋白酶B在从用载体、ACC和顺铂处理的小鼠切除的LLC肿瘤中的活性时，发现与载体处理的小鼠相比，ACC和顺铂处理的肿瘤中的活性显着降低（图3）。
图3
Figure3:TheeffectofthedifferenttreatmentsonCathepsinBactivity(n=8,pergroup).Dataispresentedasthemean±SEM.Differentlettersrepresentstatisticalsignificancep0.05.
我们的假设是ACC由于提高了肿瘤微环境的pH值而具有抗肿瘤作用。提高TME中的pHe与较低的转移、较低的增殖率、较低的组织蛋白酶B水平、增加免疫系统在肿瘤环境中的反应能力并降低化疗耐药性。
当ACC与顺铂联合使用时，肿瘤生长速度减慢的增强效果可能表明化疗耐药性降低。顺铂改变肿瘤细胞代谢并降低其糖酵解代谢，伴随着氧化磷增加。顺铂的这种代谢转变可能是图3中组织蛋白酶B活性降低的原因。
至于强化联合治疗；可能是通过ACC提高pHe增强了顺铂对肿瘤细胞的抗增殖作用以及代谢向氧磷的转变，从而导致致瘤性降低。
最近的一项研究表明，碳酸根离子对顺铂与DNA的结合没有影响，进一步证明ACC和顺铂的这种联合作用是由于碳酸根离子升高了pHe。
*04
异种移植实验揭示了与对照相比，ACC处理的动物在两个实验（图4A和4B）中肿瘤生长速率减速的相似模式。
尽管对照肿瘤生长速率有一些变化，但在第二个实验中，与第11天和最终平均体积为mm3（图4A），ACC处理的动物在两个实验中显示出相似的肿瘤生长速率模式，达到相同的平均最终体积mm3（图4A和4B），超过一半的大小控制。
图4
Figure4:XenograftmodelofANSCLChumanlungcancertransplantedsubcutaneouslyintonudemice.These2graphsrepresentsresultsoftwoexperiments.Treatments,ACCorve-hicle,weregivendailyviaIPinjections.GraphAn=12pergroups,andgraphBn=7,pergroup.Dataispresentedasmean±SEM.
两次重复实验的结果显示两者的模式相似，其中ACC治疗装饰了肿瘤生长速率（图4A和4B）。
虽然，在图4B中，对照治疗动物的生长速度更快，但ACC治疗导致类似的生长速度降低，最终平均肿瘤体积为~mm3，而对照组的体积是对照组的两倍（图4A中的~mm3和mm3）在图4B中）。
*05
图5(a)：描绘了火山图，每个点表示基因，其Log2倍数变化与p值的关系。浅蓝色点表示显着下调的基因。红点表示显着上调的基因。灰点表示差异表达但未超过阈值的基因。
图5(b)：描绘了ACC处理的A细胞(AA1-A3)与未处理的细胞(AB1-B3)的聚类基因图像。每列代表一个批次，基因被过滤以仅保留差异表达的基因。
log2归一化计数被标准化为每个基因具有零均值和单位标准偏差。使用欧几里得距离度量使用K均值聚类对标准化日志计数进行聚类。表达谱伴随着一个颜色条，指示标准化的log2归一化计数。
图5
Figure5.ALungcancercellsdifferentialgeneexpressionwasevaluatedinACCtreatedcellsversusnon-treatedcells.
众所周知，癌细胞会发生遗传和表观遗传变化，这些变化会导致支持其多方面癌性表型的变化。
在这项研究中，我们评估了A细胞系（一种人类NSCLC系）的差异基因表达，该细胞系在培养基中有或没有ACC的情况下培养。结果显示基因表达模式的深刻改变（图5A和5B）在本质上几乎是相反的（图5B）。
*06
A细胞与ACC或含CaCl的常规培养基培养的差异基因表达实验结果显示，个基因被上调，个基因被完成调节，导致总共个基因在a中差异表达。统计方式（表1）。
表1
Table1.DifferentialgeneexpressionsinAlungcancercellstreatedwithACC